（1） 反式作用因子是真核细胞中基因表达的特异性转录调控因子，能直接或间接地识别结合 DNA 调控序列，参与基因转录调控的蛋白质因子。它们一般是 DNA 结合蛋白，具有两大类结构域：一类为 DNA 识别结构域，另一类为转录活化域。
（2）DNA 识别结构域具有共同的结构模式：螺旋-转折-螺旋 （helix turn helix, HTH）：主要是两个α螺旋区和将其隔开的β转角。其中的一个称为识别螺旋区，带有数个直接与 DNA 序列相识别的氨基酸。锌指 （zinc finger）：长约 30 个 aa，其中 4 个氨基酸 （2 个 Cys, 2 个 His） 与一个 Zinc 原子相结合。碱性亮氨酸拉链 （basic leucine zipper, bZIP）：亲脂性的α螺旋，包含有许多集中在螺旋一边的疏水氨基酸，两条多肽链以此形成二聚体。每隔 6 个残基出现一个亮氨酸。碱性螺旋-环-螺旋 （helix loop helix, bHLH）：两个两性α螺旋，两个螺旋之间由环状结构相连，DNA 结合功能是由一个较短的富碱性氨基酸区所决定的。同源域 （Homeodomain）：来自控制躯体发育的基因，长约 60 个氨基酸，其中的 DNA 结合区与 helix-turn-helix 相似，主要与 DNA 大沟相结合。
相同点：它们都包含了生物体内某类生命物质的总和，并通过对其所包含的生命物质进行研究，建立了相应的组学。不同点：（1） 包含的物质不同。基因组是生物体内遗传信息的集合，是某个特定物种细胞内全部 DNA 分子的总和；转录组是指生命单元（通常是一种细胞）所能转录出来的可直接参与蛋白质翻译的 mRNA（编码 RNA） 总和；蛋白质组是指一个基因组所表达的全部蛋白质；代谢组是指生物体内源性代谢物质的动态整体，目前只涉及相对分子质量约小于 1000 的小分子代谢物质。（2） 不同组学研究的内容不同。基因组学是阐明整个基因组的结构、结构与功能关系以及基因之间相互作用的科学，包括 3 个不同的亚领域，即结构基因组学、功能基因组学和比较基因组学；转录组学是在整体水平上研究细胞编码基因转录情况及转录调控规律的科学，转录组学研究的主要技术包括微阵列、基因表达系列分析以及大规模平行信号测序；蛋白质组学是以细胞、组织或机体在特定时间和空间上表达的所有蛋白质即蛋白质组为研究对象，分析细胞内动态变化的蛋白质组成、表达水平与修饰状态，了解蛋白质之间的相互作用与联系，并在整体水平上研究蛋白质调控的活动规律，其研究主要涉及两个方面，一是蛋白质表达模式的研究，即结构蛋白质组学，二是蛋白质组功能模式的研究，即功能蛋白质组学，双向电泳和质谱是蛋白质组学研究的常规技术；代谢组学就是测定一个生物/细胞中所有的小分子 （M≤1000D） 组成，描绘其动态变化规律，建立系统代谢图谱，并确定这些变化与生物过程的联系，核磁共振、色谱及质谱是其主要分析工具。
（1） 分子结构相对稳定，能自我复制，在前后代、连结性和稳定性；（2） 能指导蛋白质的合成，从而控制整个生命过程；（3） 有贮存巨大数量遗传信息潜在能力；（4） 能引起可遗传的变异。因此，DNA 分子双链且序列互补能保证稳定地传递给后代；DNA 通过转录和翻译最后向蛋白质，因此，要求能与 RNA 形成碱基互补以实现转录；DNA 在复制时，会出现碱基错配，因此要求 DNA 聚合酶具有校对功能，来保证亲代和子代 DNA 之间的稳定性。
端粒 （telomeres） 指真核细胞线性染色体末端的一组串联重复 DNA 序列，它能防止染色体重组和末端降解酶起作用，从而维持染色体的稳定。端粒随细胞分裂次数的增加逐渐缩短而被认为起着“生物时钟”的作用，其长度的维持有赖于一种 RNA 酶即端粒酶的存在。端粒酶 （telomerase） 是一种 RNA 与蛋白质的复合体，它以自身 RNA 上的一个片段为模板通过逆转录合成端粒重复序列，并通过一种 RNA 依赖性聚合酶（如逆转录酶）机制加到染色体 3′末端以延伸端粒。大部分肿瘤细胞和生殖细胞中都含有活化的端粒酶，使细胞获得无限增殖能力。
重复；缺失；倒位。转座子插入后往往会造成插入位置上出现受体 DNA 的少数核苷酸对的重复，当复制性转座发生在宿主 DNA 原有位点附近时，往往导致转座子两个拷贝之间的同源重组，引起 DNA 缺失或倒位。
DNA 的二级结构可分为两大类：一类是右手螺旋，如 A-DNA 和 B-DNA，DNA 主要以右手双螺旋的 B-DNA 形式存在；另一类是左手螺旋，即 Z-DNA。DNA 二级结构的多态性是指在生物活体中，DNA 的结构是时刻变化的，在其二级结构的各种构象间存在一个动力学平衡。（1） B-DNA: 在相对湿度为 92%时的 DNA 钠盐。是最常见的 DNA 构象。（2） A-DNA: 在相对湿度为 75%以下时的 DNA 纤维，具有与 B-DNA 相似的右手螺旋，但其螺旋宽而短，每个螺旋含 11bp，大沟变细加深，小沟变宽而浅；DNA-RNA 杂交分子也具有与 A-DNA 相似的结构。（3） Z-DNA: 左手螺旋 （A. Rich 的工作），螺旋细长，每圈螺旋含 12bp，比 A-DNA 转得更紧，大沟平坦，小沟狭而深，双螺旋的轴心在碱基对之外，螺旋骨架呈 Z 字形。
原核生物复制的起始就是形成起始复合体的过程，这是一个有多种蛋白质及酶参与的复杂过程，主要组分有：（1） DnaA 蛋白：识别复制起始序列，在起始特异位置解开双链；（2） DnaB 蛋白：解开 DNA 双螺旋链；（3） DnaC 蛋白：辅助 DnaB 在起始点上结合并打开双链；（4） DNA 结合蛋白 HU：非组蛋白，诱导双链 DNA 弯曲，促进复制起始；（5） 引物合成酶 （DnaG）：合成 RNA 引物；（6） SNA 旋转酶（拓扑异构酶 II）：释放 DNA 解链过程中产生的扭曲张力；（7） SSB（单链 DNA 结合蛋白）：结合单链 DNA，维持单链结构；RNA 聚合酶：促进 DnaA 活性；（8） Dam 甲基化：使起点 GATC 序列的腺嘌呤甲基化。
与原核细胞不同，真核细胞中复制起始的两个步骤发生在细胞周期的不同时期，DNA 复制的起始需要在前复制复合体 pre-RC 的指导下进行：在 G1 期，激酶 Cdk 的水平低，新的 pre-RC 虽能形成但不具备活性；在 S 期，Cdk 活性的提高引发 DNA 复制的起始，并阻止在前一轮复制产生的 DNA 上形成其他新 pre-RC，保证了每个细胞周期中每条染色体只复制一次。
SOS 反应是由 RecA 蛋白和 LexA 阻遏物相互作用引起的。正常情况下，recA 基因被 LexA 蛋白部分阻遏不能正常表达 RecA 蛋白，但当有单链 DNA 和 ATP 存在时，recA 基因大量表达产生 RecA 蛋白，RecA 蛋白被激活而表现出蛋白水解酶的活力，它能分解入噬菌体的阻遏蛋白和 LexA 蛋白。LexA 蛋白 （22KD） 是许多基因的阻遏物，它被 RecA 的蛋白水解酶分解后就可以使一系列基因得到表达，其中包括紫外线损伤的修复基因 uvrA、uvrB、uvrC（分别编码核酸内切酶的亚基）以及 recA 和 lexA 基因本身，还有单链结合蛋白基因 ssb，与入噬菌体 DNA 整合有关的基因 himA、与诱变作用有关的基因 umuDC，与细胞分裂有关的基因 sulA、ruv 和 lon，以及一些功能不清楚的基因 dimA、dimB、dimD、dimF 等。
转座作用的遗传学效应主要有以下几方面：（1） 引起插入突变：各种 IS, Tn 转座子都可以引起插入突变。如果插入位于某操纵子的前半部分，就可以造成极性突变，导致该操纵子的后半部分结构基因的表达失活。（2） 转座产生新的基因：如果转座子上带有抗药性基因，它一方面造成靶 DNA 序列上插入突变，同时也使该位点产生抗药性。（3） 转座产生染色体畸变：当复制性转座发生在宿主 DNA 原有位点附近时，往往导致转座子两个拷贝之间的同源重组，引起 DNA 的缺失或倒位。若同源重组发生在两个正向重复转座区之间，导致宿主染色体 DNA 缺失；而当重组发生在两个反向重复转座区之间，则引起染色体 DNA 倒位。（4） 转座引起生物进化：由于转座作用，一些原来在染色体上相距甚远的基因组合到一起，合成新的基因。
RNA 编辑 （RNA editing） 是某些 RNA，特别是 mRNA 的一种加工方式，通过插入、删除或取代一些核苷酸残基，使 DNA 所编码的遗传信息发生变化，是细胞内改变 mRNA 序列和蛋白质编码信息的重要途径。
（1） 介导 RNA 编辑的机制。
位点特异性脱氨基作用：载脂蛋白 mRNA 中的 C→U，谷氨酸受体蛋白 mRNA 中的 A→I，都属于脱氨基作用的结果。分别由胞嘧啶和腺嘌呤脱氨酶所催化。指导 RNA 引导的尿嘧啶插入或删除：由于指导 RNA 上存在一些未能配对的腺嘌呤，形成缺口，为插入尿嘧啶提供了模板，反应完成后，指导 RNA 从 mRNA 上解离下来，而 mRNA 则被用做翻译的模板。
（2） RNA 编辑具有重要的生物学意义。
校正作用：有些基因在突变过程中丢失的遗传信息可能通过 RNA 编辑得以恢复。调控翻译：通过编辑可以构建或去除起始密码子和终止密码子，是基因表达调控的一种方式。扩充遗传信息：能够使基因产物获得新的结构和功能，有利于生物的进化。
（1） 优点：调控方便；基因结构简单。
（2） 缺点：前面的顺反子对后面的顺反子的表达有影响；后面几个顺反子翻译的起始就会受其上游顺反子结构的调控，不能独立进行。
（1） 5’端帽子是一个特殊的结构，它是由 GTP 与原 mRNA 5’端的三磷酸腺苷（或鸟苷）缩合反应的产物，新加上的 G 常常被甲基化。帽子结构至少有 4 种功能：①保护 mRNA 免遭核酸酶的破坏；②在蛋白质合成过程中，有助于核糖体对 mRNA 的识别和结合，使翻译得以正确起始；③增强 mRNA 从细胞核到细胞质的转运；④可能提高 mRNA 的剪接效率。
（2） 3’端 polyA 尾巴是在转录后经多聚 A 聚合酶的作用添加上去的。该尾巴是 mRNA 由细胞核进入细胞质所必需的形式，其功能主要是：①保护 mRNA 免遭核酸酶的破坏，提高了 mRNA 在细胞中的稳定性；②增强 mRNA 的可翻译能力；③在 mRNA 的转运出核时发挥特异性的作用。
多聚 A 尾的生成是在多聚 A 聚合酶的催化下，由 ATP 聚合而成，但多聚 A 尾形成并不是简单地加入 A。几乎所有真核基因的 3’端转录终止位点上游 15~30bp 处有一段 AAUAAA 保守序列，加多聚 A 时，首先在 UTsnRNP 的协助下识别 mRNA 3’端的保守序列，再由一种特异性的核酸内切酶催化切除多余的核苷酸，随后，在多聚 A 聚合酶催化下，以带有 3’-羟基的 RNA 为模板，ATP 为供体，Mg++或 Mn++及多种蛋白质参与下，发生聚合反应，形成了 3’端多聚 A 尾。
（1） 泛素 （ubiquitin）：是一类低相对分子质量的蛋白质，只有 76 个氨基酸残基，高度保守，构象上具有典型的ββαββαβ折叠。
（2） 泛素化 （ubiquitination）：是指泛素分子在泛素激活酶 E1、结合酶 E2、连接酶 E3 等的作用下，其 C 端甘氨酸残基通过酰胺键连接到靶蛋白赖氨酸残基的 e 位氨基上的过程。
（3） 泛素化的生物学意义：起始蛋白质的降解；有些泛素化还能参与多种生物功能的调控，在蛋白质的定位、代谢、功能、调节和降解中都起着十分重要的作用，能参与细胞周期、增殖、凋亡、分化、转移、基因表达、转录调节、信号传递、损伤修复、炎症免疫等几乎一切生命活动的调控；泛素化也是研究、开发新药物的新靶点。
核糖体至少有 5 个活性中心：
（1） mRNA 结合位点：位于核糖体 30S 亚基上，在肽基转移位点附近，其功能是结合 mRNA 和 IF 因子。
（2） AA-tRNA 结合位点 （aminoacyl-tRNA site, A 位点）：即氨酰基位点，是与新掺入的氨酰-tRNA（aminoacyl-tRNA） 结合的位点，又叫受位 （entry site），主要位于大亚基，是接受氨酰-tRNA 的部位。
（3） 肽酰-tRNA 结合位点 （peptidyl-tRNA site, P 位点）：又叫供位 （donor site），或肽酰基位点，主要位于大亚基，是与延伸中的肽酰-tRNA 结合的位点。
（4） 转肽酶活性中心：位于 P 位和 A 位的连接处，是形成肽键的部位。
（5） 负责肽链延伸的各种延伸因子的结合位点。
链霉素是一种碱性三糖，能干扰 fMet-tRNA 与核糖体的结合，从而阻止蛋白质合成的正确起始，也会导致 mRNA 的错误。主要抑制革兰氏阴性细菌蛋白质合成的三个阶段：（1） 与 30S 核糖体结合，抑制起始复合物的形成，使氨酰-tRNA 从复合物中脱落；（2） 在肽链延伸阶段，使氨酰-tRNA 与 mRNA 错配；（3） 在终止阶段，阻碍终止因子与 mRNA 结合，使已合成的多肽链无法释放，而且还抑制核糖体的解离。
抗生素对蛋白质合成的抑制作用可能是阻止 mRNA 与核糖体的结合，或阻止 AA-tRNA 与核糖体结合，或干扰 AA-tRNA 与核糖体结合而产生错误等。但不同的抗生素作用的对象并不完全相同：卡那霉素、青霉素、四环素和红霉素只与原核细胞核糖体发生作用，从而阻遏原核生物蛋白质的合成，抑制细菌生长；放线菌酮则只作用于真核生物核糖体；而氯霉素、链霉素、蓖麻霉和噻吩霉素既能与原核细胞核糖体结合，又能与真核生物核糖体结合，妨碍细胞内蛋白质合成，影响细胞生长。
还需要包括：具有抗菌素抗性基因；多克隆位点；启动子；前导序列；加尾信号。
一种理想的用作克隆载体的质粒必须满足如下几个方面的条件：具有复制起点；具有抗菌素抗性基因；具若干限制酶单一识别位点；具有较小的相对分子质量；较高的拷贝数；还应具备与宿主细胞相适应的启动子、前导顺序、增强子、加尾信号等 DNA 调控元件。
限制性内切酶由细菌产生，能识别双链 DNA 的特定序列，并水解该序列内部或附近的磷酸三酯键。根据其组成、活性和特异性等的不同，可分为三类。
Ⅰ类限制性核酸内切酶：由 3 种不同亚基构成，兼具有修饰酶活性和依赖于 ATP 的限制性内切酶活性，它能识别和结合于特定的 DNA 序列位点，去随机切断在识别位点以外的 DNA 序列通常在识别位点周围 400~700bp。这类酶的作用需要 Mg²⁺、S 腺苷甲硫氨酸及 ATP。
Ⅱ类限制性核酸内切酶：与Ⅰ类酶相似，是多亚基蛋白质，既有内切酶活性，又有修饰酶活性，切断位点在识别序列周围 25~30bp 范围内，酶促反应除 Mg²⁺外，也需要 ATP 供给能量。
Ⅱ类限制性核酸内切酶：只由一条肽链构成，仅需 Mg²⁺，切割 DNA 特异性最强，且就在识别位点范围内切断 DNA。是分子生物学中应用最广的限制性内切酶。通常在重组 DNA 技术提到的限制性核酸内切酶主要是指Ⅱ类限制性核酸内切酶。
几乎所有限制性内切酶都有对应的甲基化酶，后者能够识别相同的位点并对其甲基化，被甲基化之后，DNA 的酶切位点就被保护了起来，所以，宿主细胞中甲基化的 DNA 就不会受到损伤。
由于基因组 DNA 文库和 cDNA 文库的建库过程不同，产生的基因结构也不同，因此其应用范围也不相同。主要区别表现在：基因组文库克隆的是任何基因，包括未知功能的 DNA 序列，cDNA 文库克隆的是具有蛋白质产物的结构基因，包括调节基因；基因组文库克隆的是全部遗传信息，不受时空影响，cDNA 文库克隆的是组织细胞的 mRNA 信息；基因组文库中的编码基因是含有内含子和外显子，而 cDNA 克隆的基因不含内含子；基因组 DNA 文库可用于分离特定的基因片段、分析特定基因结构、研究基因表达调控，还可用于全基因组物理图谱的构建和全基因组序列测定等，cDNA 文库则主要用于筛选目的基因、大规模测序、基因芯片杂交等功能基因组学的研究。
体外 PCR 与体内 DNA 复制的差异主要体现在以下几个方面：细胞内 DNA 的复制是半不连续复制，而 PCR 中，DNA 是连续复制；细胞内的 DNA 复制时，不需要将双链完全解开形成单链，按半不连续方式进行 DNA 的复制，而 PCR 反应中，DNA 双链必须完全解链，复制过程都是连续进行的；细胞内的 DNA 复制时，DNA 的解链通过解链酶催化，而 PCR 反应中是通过高温使双链解离；细胞内的 DNA 复制时，引物是通过 RNA 聚合酶合成的 RNA 链，为单引物，而 PCR 反应中所需的引物是人工合成的寡聚核苷酸，是双引物；细胞内的 DNA 复制时，温度保持一致，而 PCR 反应中，温度在解链温度、退火、延伸 3 个温度之间变化。
基因表达载体除了具备克隆载体的特征以外，还需具有以下主要特征：
（1） 强的启动子：基因转录由启动子控制，选用强启动子可提高克隆基因转录的表达水平。（2） 强的核糖体结合位点：靠近起始密码子上游，可提高 mRNA 翻译效率。（3） 终止信号：基因表达水平也受转录终止信号（终止子）和翻译终止信号（终止密码子）的影响，在三个终止密码子中以 UAA 的终止能力最强。
（1） 复制起始点 （ori）：决定载体在宿主细胞内的拷贝数，适度的拷贝数有利于外源基因高效表达，否则载体在宿主细胞内不稳定。（2） 选择性标记：供宿主细胞筛选，并确定载体是否进入细胞。（3） 控制转录的强启动子和终止子：启动子调控转录起始的效率，启动子序列常在基因或操纵子编码序列的上游，可以与 RNA 聚合酶特异性结合并使之开始转录；一般在多克隆位点的下游插入一段很强的核糖体 RNA 的转录终止子，能有效控制外源基因转录产物 RNA 过长，提高 RNA 稳定性，可避免载体上其他基因的异常表达。（4） 多克隆位点：含合理设计的多克隆位点，以确保目的基因按一定方向与载体连接，形成重组体分子。（5） 翻译调控的核糖体结合位点、起始密码和终止密码子等序列元件：调控翻译起始、终止以及翻译效率，mRNA 的翻译效率受 SD 序列与 16S rRNA 3’端互补程度的影响，还受 SD 序列与起始密码子间的距离 （6～8bp，多为 7bp） 以及起始密码子上、下游序列的影响；三个终止密码子中以 UAA 的终止能力最强。
成功提取 mRNA，最关键的问题是抑制 RNA 酶活性。因为 mRNA 呈单链状，受到核酸酶的攻击。
细胞中的总 RNA 包括 mRNA、rRNA、tRNA 以及一些小 RNA（sRNA）。RNA 的提取，是进行 RNA 方面的研究工作的前提。所有 RNA 的提取过程中都有五个关键：（1） 样品细胞或组织的有效破碎；（2） 有效地使核蛋白复合体变性；（3） 对内源 RNA 酶的有效抑制；（4） 有效地将 RNA 从 DNA 和蛋白混合物中分离；（5） 对于多糖含量高的样品还牵涉到多糖杂质的除去。但其中最关键的是抑制 RNA 酶活性。
总 RNA 提取的方法有多种，主要有 LiCl 法、CTAB 法、异硫氰酸胍法 （Trizol）。
异硫氰酸胍法 （Trizol） 原理：Trizol 试剂中的主要成分为异硫氰酸胍和苯酚，其中异硫氰酸胍可裂解细胞，促使核蛋白体的解离，使 RNA 与蛋白质分离，并将 RNA 释放到溶液中。当加入氯仿时，它可抽提酸性的苯酚，而酸性苯酚可使使 RNA 进入水相，离心后可形成水相层和有机层，这为分离 DNA 和蛋白质提供了方便。
（1） 提取高质量的组织或细胞总 RNA，质量检测合格；（2） 使用 poly（T） 磁珠富集 mRNA 并打断成短片段；（3） 用随机引物反转录成 cDNA，并进行 DNA 末端修复；（4） 加碱基 A、加测序接头；（5） 进行 PCR 扩增后建库；（6） 选择合适的平台测序。
（1） 无需打断转录本，直接进行测序；（2） 平均 10～15kb 的读长可以轻松跨越从 5′端到 3′-poly（A） 尾巴的完整转录本；（3） 准确鉴定异构体，并对可变剪接、融合基因、同源基因、超家族基因或等位基因表达等进行精确分析；（4） 实践中常将各个组织混合进行三代测序得到准确的全长转录物；（5） 通过对各个组织或者细胞样本单独进行二代测序，从而准确鉴定基因在各个组织中的表达水平。
RNA-seq 技术通过高通量测序技术对转录组进行测序分析，对测序得到的大量原始读长 （reads） 进行过滤、组装及生物信息学分析的过程称为 RNA-Seq。对于有参考基因序列的物种，需要根据参考序列进行组装；对于没有参考序列的，需要从头组装，利用大量读长之间重叠覆盖和成对读长的相对位置关系，组装得到尽可能完整的转录本，并以单位长度转录本上覆盖的读长数目作为衡量基因表达水平的标准。在实际组装过程中，覆盖度过低且读长缺乏相对位置信息的区域，其可信度较低，应当剔除，保留两侧序列。
Illumina 二代高通量测序技术是基于合成的循环微阵列测序技术，是一种边合成边测序技术，基于专有的可逆末端终止化学反应原理。现已商业化并被广泛应用，具有准确性高、通量高、灵敏度高和运行成本低等突出优势，可以同时完成传统基因组学研究（测序和注释）以及功能基因组学（基因表达及调控、基因功能、蛋白/核酸相互作用）研究。
步骤是：首先用超声或氮气等方法将 DNA 随机打断成 100~200bp 片段，再在两端加上通用接头，然后进行 PCR 扩增，构建 SSDNA 文库；将接好接头的待测 DNA 片段放入含有基片的流通池内，片段的另一端因随机与附近的另一接头序列互补而被固定，使得打断的 DNA 片段两端固定在基片上，形成桥状结构，即桥连 PCR 扩增；在 8 个 8 微流道的测序芯片上进行测序。测序过程中，测序引物与待测模板末端的共同接头序列杂交，在 DNA 聚合酶催化下以 4 种经化学修饰的核苷酸为底物开始合成待测序列的互补链，这 4 种核苷酸在 3’-OH 位置上被加了一个可切除的修饰基团，阻碍了下一个核苷酸的整合，类似于一个可逆聚合反应终止子的作用，保证在每轮链延伸过程中只有一个碱基整合；另外，每个核苷酸带有一个可切除的荧光标记，用于序列信号的检测。在每轮链延伸和相应的荧光图像信号检测后，链终止修饰基因和荧光标记基因被切除，为下轮反应做准备，可以重复几十个循环。故 Illumina 测序技术的测序与 DNA 片段合成反应是同步的。
应用：Illumina 二代高通量测序技术的开发与应用极大地加速了基因组重测序、宏基因组测序、DNA 甲基化测序、转录组测序、目标基因组区域再测序、基因的表现遗传修饰检测、微生物检测等领域的研究工作，解决了第一代测序技术无法大规模进行试验的现实问题。
病毒性载体
主要优点：易于分离制备，容量大，效率高，宿主范围广，逆转录病毒载体介导的外源基因能在靶细胞中永久表达。主要缺点：逆转录病毒载体随机整合，有插入突变、激活癌基因的潜在危险；腺病毒载体可能产生复制型腺病毒，且宿主的免疫反应导致腺病毒载体表达短暂；可能会引起免疫排斥；插入外源 DNA 的长度有限，可能会删除病毒的非必需基因，还可能删除部分必需基因，这些必需基因的功能由辅助病毒或宿主细胞提供；制备复杂且费用较高。
非病毒载体
主要优点：除了较病毒载体系统低毒和低免疫反应之外，其携带的外源基因整合到宿主基因组中的概率很低，而且非病毒载体系统不受基因插入片段大小的限制，使用简单，获得方便，便于保存和检验。主要缺点：易被靶细胞内单核-吞噬细胞系统、溶酶体等选择性吞噬、降解。
CAR-T, chimeric antigen receptor T-cell immunotherapy, 即特异性嵌合抗原受体免疫治疗，是通过基因修饰获得携带识别肿瘤抗原特异性受体 T 细胞的个性化治疗方法。具体操作是：先提取患者外周血 T 细胞，通过基因重组赋予 T 细胞特异性识别肿瘤抗原的能力，再将改造后的 T 细胞经体外扩增后回输到患者体内，从而特异性杀伤肿瘤细胞。
优点：与传统的 T 细胞识别抗原相比，CAR 通过增加共刺激分子信号增强了 T 细胞对肿瘤的杀伤力，因此，CAR-T 细胞可以克服 MHC 分子表达下调和共刺激分子减少等肿瘤细胞免疫逃逸机制；另外，CAR 可以针对任何类型的表面抗原，包括糖和糖脂类，提高了识别范围。该免疫疗法在白血病和淋巴瘤患者的早期临床实验中取得了显著疗效。缺点：CAR-T 的主要副作用是引发细胞因子释放综合征，导致患者发高烧或血压急剧下降，可能需要采取额外的处理措施；CAR-T 在实体瘤中尚未取得满意的疗效。
癌细胞是一种变异的细胞，是产生癌症的病源，它除了仍具有来源细胞的某些特性（如上皮癌仍可合成角质蛋白）外，还表现出癌细胞独具的特性：①无限增殖：癌细胞增殖能力很强，在适宜条件下，癌细胞能无限增殖，成为“不死”的水生细胞。②接触抑制现象丧失：正常细胞生长相互接触后，其运动和分裂活动都要停顿下来，癌细胞则不同，其分裂和增殖并不因细胞相互接触而终止，故癌细胞接触对癌细胞的增殖无抑制作用。③癌细胞间黏着性减弱：癌细胞与其同源正常组织相比，细胞间的黏着性降低，故癌细胞在体内容易分散和转移。在正常细胞外被中的纤黏连蛋白是一种细胞外黏着糖蛋白，它增强了细胞与细胞外基质间的黏着。癌细胞的纤黏连蛋白显著减少或缺失，钙黏蛋白合成发生障碍，从而破坏了细胞与基质之间和细胞与细胞之间的黏着，因此癌细胞具有易于浸润蔓延、侵袭周围的细胞和组织甚至扩散转移的属性。此外，癌细胞还具有黏壁性下降、细胞骨架结构素乱、产生新的膜抗原、易于被凝集素凝集、对生长因子需要量降低等特征。正是由于上述特征，癌细胞能够快速增殖，不断夺取人体中的营养，同时产生一些毒素，所以会严重威胁人类的健康。
由于癌细胞异常迅速且不受约束和控制、无规律地生长繁殖，而且一旦遇到不利的条件（刺激、中伤），它就能转移甚至隐匿起来，癌细胞具有不吃不动的休眠、假死本领，使得细胞由分裂增殖期迅速进入 G 期，任何药物都对它没有什么疗效，所以对其防治十分困难。
可以结合生理学、毒理学、药理学或者各种临床指标进行下面几方面的评价。
（1） 安全性：生物技术药物的原材料和表达系统往往都具有生物活性，个体间差异较大，要考察所用原材料、表达系统和药品本身的安全性，需做毒性实验和临床检验。（2） 有效性：检测该药物对靶细胞的作用能力，对癌细胞作用的特异性是否很强，相对分子质量是否过大，能否顺利地到达病灶，并在宏观上对癌细胞有没有很好的抑制和杀伤作用，疗效是否确切。（3） 稳定性：对药物生产涉及的原材料、中间产物以及终产品的稳定性进行考察，包括加工过程的稳定性和贮藏稳定性。（4） 适合人群：对不同生理状态和体质人群的适用性。
当细菌处于贫瘠环境，缺乏氨基酸提供蛋白质合成即关闭大部分的代谢活性，这种现象称为严紧反应，它是细菌适应逆境的重要机制之一。任何一种氨基酸的缺乏，或突变导致任何一种氨酰-tRNA 合成酶的失活都会引起严紧反应。原核生物的严紧反应主要积累 （p）ppGpp，产生这种物质的诱导物是空载 tRNA。