JiaoYuan's Blog

实验

蛋白质
- 含量测定
  - 与茚三酮反应
    - 紫色产物
      - 570nm（脯氨酸为亮黄色产物 440nm），可区分α、β、γ氨基酸
  - 凯式定氮法
    - 最经典
  - 双缩脲反应
    - 紫色络合物
      - 540nm
  - Folin-酚试剂法
    - Trp、Tyr
      - 蓝色络合物
  - 紫外光吸收法
    - Trp、Tyr
      - 280nm
  - 考马斯亮蓝结合法
    - 洋红色->蓝色
      - 465nm->595nm
  - 胶体金测定法
    - 洋红色->蓝色
      - 最精确
  - 甲醛滴定法
    - Pro 结果偏低、Tyr 结果偏高
    - 用 NaOH 滴定氨基酸-NH³⁺的 H⁺
- 纯度测定
  - N 末端分析法、超离心沉淀（单一沉降速度）、电泳（单一速度）、HPLC（单一对称峰）
- 测序
  - 末端残基分析
    - N 端
      - 2,4-二硝基氟苯 FDNB（黄色物质）、丹磺酰氯（DNS-Cl）/达磺酰氯标记、氨肽酶、PITC
    - C 端
      - 羧肽酶断裂 C 端氨基酸、肼解
  - 断裂二硫键
    - 过甲酸（胱氨酸）或二硫苏糖醇（Cys）还原
  - 部分裂解
    - 胰蛋白酶
      - Lys、Arg 羧基侧（赖精）（Arg 与 Pro 相连不能断裂）
    - 腺蛋白酶
      - Arg 羧基侧
    - 胰凝乳蛋白酶
      - Phe、Trp、Tyr 等疏水氨基酸羧基侧（苯丙色酪）
    - 葡萄球菌蛋白酶
      - Glu、Asp 羧基侧（天冬谷）
    - 嗜热菌蛋白酶
      - 水解疏水性的时较快，Phe、Trp、Tyr、Leu、Ile、Met、Val 的 N 端
    - 羧肽酶
      - A：断裂除 Arg、Lys、Pro、Hyp 以外的所有 C 端氨基酸
      - B：释放 C 端的 Arg、Lys
      - C：释放除 Hyp 以外的所有 C 端氨基酸
      - Y：释放所有 C 端氨基酸
    - Asp-N-蛋白酶
      - Glu、Asp 氨基侧（天冬谷）
    - 胃蛋白酶
      - Phe、Trp、Tyr、Val 等疏水氨基酸氨基侧（苯丙色酪缬），可断二硫键
    - 内切蛋白酶
      - Lys 羧基侧
    - CNBr
      - Met 羧基侧
    - 羟胺 NH₂OH
      - Asn-Gly 之间
  - 肽段氨基酸序列测定
    - Edman 化学降解法
      - 用 PITC，准确度只有 50-60 个残基、操作麻烦、工作量大
    - 质谱
      - 根据质核比、可测定相对分子质量、分析结构组成，生物质谱和串联质谱
      - 亮氨酸和异亮氨酸分不开（相对分子质量相同）
- 成分测定
  - Western 印迹
    - 可检测微量成分与近似相对分子质量
- 相对分子质量测定
  - 凝胶过滤、SDS-PAGE、质谱、超离心
- 分析分离
  - 层析
    - 分配层析（分配系数、溶解度差异）、双向纸层析离子交换层析（电荷行为，DEAE-纤维素（阴），CM-纤维素（阳））
  - 电泳
    - 纸电泳
      - 分配系数 K=固定相中浓度/流动相中浓度
  - 超滤、超离心（不能透过半透膜）、逆流分溶（与纸电泳原理一样）
  - 硅胶薄层层析
    - Rf 值与非极性成正比
- 三级结构测定
  - X 晶体射线衍射法（无法测单分子）、NMR（原子水平）、紫外差光谱、荧光和荧光偏振（色酪）、圆二色性（CD）
酶
- 酶联免疫吸附测定（ELISA）：快速筛查和定量抗原，以待测抗原和酶标抗体的特异性反应为基础
核酸
- 分离
  - 超速离心
    - 蔗糖或甘油
  - 琼脂糖凝胶电泳（大片段）
    - 碱性染料或银染（溴化乙锭 EB）染色
  - 聚丙烯酰胺凝胶电泳（小片段）
  - oligo-dt/oligo-u-spharos（分离 mRNA）
    - 常与纤维素偶联
- 纯化
  - 苯酚法、氯仿-辛醇法、SDS 法（常用方法，SDS、广谱蛋白酶 K）氯化铯密度梯度离心（蛋白质在最上层、DNA 中间、RNA 下层）可测定密度、差速离心法
- 测序
  - DNA
    - 加减法（DNA 酶法）
      - 需要 DNA 聚合酶 3-5-外切酶
    - 双脱氧链终止法
      - 一种 dNTP 被标记，需要 ddNTP 终止 DNA 合成
        
        1980 诺奖
    - 化学测序法
      - 不合成 DNA 链
        
        A.M.Maxam 和 F.Gilbert
  - RNA
    - 酶特异切断 RNA 链、化学试剂裂解 RNA、逆转录法（将 RNA 逆转录为 cDNA 进行测序）质谱法
  - 二代、三代测序
- 含量测定
  - 定磷法
    - 有机磷->无机磷->磷钼酸->钼蓝
      - 660nm
  - 定糖法
    - RNA 与盐酸->糖醛+甲基苯二酚（三氯化铁）->鲜绿色
      - 670nm
    - DNA 与苯胺->蓝色化合物
      - 595nm
  - 紫外分光光度法
    - 测出 A260，1 相当于 50 微克/ml 双螺旋 DNA/40 微克/ml 单链 DNA/RNA/20 毫克/ml 寡核苷酸
  - 苔黑酚法（RNA）
    - 绿色复合物
  - 二苯胺法（DNA）
    - 蓝色化合物
      - 595nm
  - Northern plot
    - Southern plot
      - 基因探针
糖类
- 含量测定
  - Fehling 试剂和 Benedict 试剂（含铜离子的碱性溶液）
    - 还原糖检测与定量测定
    - 生成红色或黄色的氧化亚铜
  - 邻甲苯胺（热的乙酸溶液中）
    - 生成青色的 schiff 碱
      - 630nm
  - 在浓硫酸作用下生成糠醛或羟甲基糠醛
    - 与蒽酮反应生成蓝绿色糠醛衍生物
      - 620nm
  - 还原糖在碱性条件下加热氧化成糖酸
    - 使 3,5-二硝基水杨酸被还原为棕色的 3-氨基-5-硝基水杨酸
    - 在过量的 NaOH 中为橘红色
      - 540nm
- 鉴定
  - Molisch 试验
    - 经浓硫酸脱水生成糠醛及其衍生物，与α-萘酚作用
      - 红色物质
        
        鉴定糖类
  - Seliwanoff 试验
    - 经浓盐酸脱水生成甲基糠醛，与间笨二酚作用
      - 红色物质
        
        鉴定己酮糖
  - Tollen 试验
    - 经浓盐酸脱水生成糠醛，与间三苯酚作用
      - 樱桃红色物质
        
        鉴定戊糖
  - Bial 试验
    - 经浓盐酸脱水生成糠醛，与甲基间二苯酚（苔黑酚）作用
      - 绿色物质
        
        戊糖鉴定和 RNA 测定
- 定位糖苷键（甲基化法）、单糖序列测定（外切糖苷酶、质谱法、核磁共振）、三维结构测定（核磁共振谱法）

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